Calcein AM /PI试剂盒

钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。

I. 试剂  Calcein-AM 4mM 50uL in DMSO; Unit Size #500 assays ·PI (2mM) 150uL in water

II. 操作说明

  用荧光显微镜观察细胞形态，以HeLa细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度，有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。

1. 染色溶液的配制

1) 将Calcein-AM储备液和PI储备液平衡到室温。

2) 分别加2.5 µl Calcein-AM原液和12.5 µl PI原液至5 mL PBS（pH=7.4）中配制成染色工作液。染色工作液中Calcein-AM的浓度为2 µmol/L，PI的浓度约为5 µmol/L。

2. 细胞染色

1) 染色HeLa细胞等贴壁细胞时，先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。

2) 将细胞悬液离心3分钟 (1,000 rpm)。

3) 去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至10⁵-10⁶个/ml。再用移液器充分混匀。

4) 由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。

5) 将200 µl细胞悬液移至小试管中，加入100 µl染色工作液，在37℃下孵育15分钟。

6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。

7) 在荧光显微镜下，先用490±10 nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

  3. 染色试剂的最佳浓度

   Calcein-AM和PI最佳浓度根据细胞种类而定，通过以下的操作，可找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。

1) 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。

2) 用0.1-10 µM PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

3) 用0.1-10 µM Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

III. 注意事项

1) Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20度下密闭冷冻保存，防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。

2) 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。

3）注意事项：本公司所有产品仅限用于研发，操作时必须戴口罩/手套/实验服和其它生化实验室防护措施。