细胞染色/凋亡及离子探针
ROS 活性氧检测试剂盒
商品编号: 040-1000T(96 孔板)
325元/套 1000T(96 孔板)
产品介绍

ROS活性氧检测试剂盒

产品组成

截屏2020-10-28 14.54.12.png

产品简介:  

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针H2DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。H2DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。根据活细胞中荧光的产生,可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察,是一种经典的组织或活细胞中活性氧检测方法。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup,以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物,浓度为50mg/mL。Rosup 为活性氧阳性诱导药物,根据其荧光信号强度,可分析活性氧的真正水平。

本试剂盒本底低,灵敏度高,线性范围宽,使用方便。试剂盒可以测定1000个样品1000T(96 孔板)。

注意事项: 本公司所有产品仅限用于研发,操作时必须戴口罩/手套/实验服和其它生化实验室防护措施。

1.      探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。

2.      阳性对照Rosup 一般使用浓度为100 μM (推荐浓度100-400μM,具体依细胞类型而定)。通常刺激后0.5-4h 可观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30min 内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。

3.      对于某些特别的细胞,实验过程中如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强, 可以按照1:2000-1:5000 稀释DCFH-DA , 使DCFH-DA 的终浓度为2-5 μM。探针装载的时间也可以根据情况在15-60 min 内适当进行调整。

4.      活性氧阳性对照(Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品,并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

5.      探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考上图。

6.      尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。

7.      本公司所有产品仅限用于研发,操作时必须戴口罩/手套/实验服和其它生化实验室防护措施。

8.      定量的话要作标准曲线吧。先做一个不同浓度H2O2氧化DCFA荧光值,做一条标准曲线,X轴为H2O2浓度,y轴是荧光值,得出一个方程,在看你样品的荧光值即Y值是多少,对应的X值就是。

9.      有的细胞装载探针后细胞容易漂起来,洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍,这样细胞紧密连接,贴壁比较牢,实验组的荧光值就高了。另外的H2DCFDA很敏感,工作液浓度要低一些,1-2μM就够啦,浓度太高容易有非特异性染色。这个探针很不稳定,一旦氧化了本底荧光值就会升高,最好工作液现用现配。

使用说明:

1. 装载ROS 探针

1.1 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)

a) 细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞数量小于5×105/ml。

b) 药物诱导:去除细胞培养液,加入无血清培养基稀释的药物处理,于37℃细胞培养箱内避光孵育,实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。

c) (可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM,加入细胞,37℃避光孵育0.5~4 h,以提高活性氧水平,不同细胞类型存在差异。例如:HeLa 细胞需孵育30-60 min,MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90 min。

d) ROS 探针准备:探针装载前按照1:1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。

e) ROS 探针装载:吸除处理药物,加入适当体积稀释好的DCFH-DA 工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如:6孔板通常不少于1000 μL,对于96 孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。

f) 细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1~2 次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)

a) 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。

b) 药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。

c) (可选)阳性对照:先用无血清培养基稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM,加入细胞,37℃避光孵育0.5~4 h 以提高活性氧水平,不同细胞类型存在差异。例如:HeLa 细胞需孵育30-60 min,MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90min。

d) ROS 探针准备:探针装载前,按照1:1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。

e) 探针装载:除去细胞内药物,离心收集细胞,加入稀释好的探针,使其细胞密度为1×106 ~ 2×107

注意:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整。例如:对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106

f) 细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2 次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

2. 荧光显微照相操作方法

a) 对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观察;对悬浮生长细胞,取25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片。

b) 荧光显微镜下,选用FITC 滤光片观察荧光,去除背景观察荧光的变化。

3. 流式细胞分析操作方法

a) 对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液;对悬浮生长细胞,直接收集细胞。用0.5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5~1 x 105/ml)。

b) 选择流式细胞仪FL1 或BL1 通道,488nm 激发,测定530nm 的发射,细胞应可分成两个亚群:ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度,ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。

4.参数设置

使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。


截屏2020-10-28 14.53.56.png 

使用活性氧检测试剂盒(Reactive oxygen species assay kit)显示CHO细胞内活性氧荧光。

左图:CHO细胞用试剂盒配备的活性氧阳性对照处理;右图:正常CHO细胞。绿色荧光表明细胞活性氧急剧增加,并能显示其定位。

特别提醒:

1) 本公司所有产品仅限于专业人员用于生命科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅!

2) 本公司所有产品必须由合格专业技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程!

产品参数
Name ROS 活性氧检测试剂盒
CAT# 040-1000T CAS# N/A
Storage# −20°C Sealed & desiccated & Minimized light exposure & Minimized Freezing And Thawing Shelf Life# 24 months
Ex(nm)# N/A Em(nm)# N/A
MW# N/A Solvent#
Name ROS 活性氧检测试剂盒
CAT# 040-1000T
CAS# N/A
Storage# −20°C Sealed & desiccated & Minimized light exposure & Minimized Freezing And Thawing
Shelf Life# 24 months
Ex(nm)# N/A
Em(nm)# N/A
MW# N/A
Solvent#
附件下载
官方微信

400-686-3443