用于 dsDNA 定量检测的FBGreen荧光染料 （～PicoGreen）

1.应用说明

    在分子生物学的试验过程中，FBGreen dsDNA 定量试剂盒是荧光检测双链 DNA 并进行定量 的一种产品，这种方法非常灵敏。常用于分子生物学技术中的：cDNA 文库的构建；用于亚克隆的  DNA 片段纯化及应用，比如进行 DNA 定量、产物扩增和引物的进一步检测。 疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。其中，疫苗的纯化是关键问题，我们需要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。

   常规的DNA含量的检测方法是在260nm（A260）处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰，无法区分DNA和RNA，而且这种方法不灵敏（5μg/mLdsDNA溶液A260=0.1）。PicoGreen定量检测方法简单、方便，被多家生物制品厂所选择，成为生物制品残留DNA检测的标准。目前该方法已纳入2010年版《中国药典》

原理:

 FBGreen与DNA双链结合后才发出的荧光，无DNA不发荧光；所发荧光与DNA浓度成正比。在2010年《中国药典》中提出，FBGreen定量DNA的方法检出限约0.3ng/ml，DNA含量在1.25-80ng/mL范围时线性较好(R2>0.99).

优点：

1）该方法可以测定来源于任何表达宿主样品中的双链DNA。

 2）可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。

 3）远远超出传统紫外A260的检测方法和Hoechst33258的灵敏度。

 4）较高浓度的盐，尿素，乙醇，氯仿，去垢剂，蛋白或琼脂糖对测定无影响。

5）在等摩尔浓度 ssDNA 和 RNA 存在的条件下测定 dsDNA，其影响很小。

2.所需器材

• 微型荧光计；便携式荧光仪-上海互帼科学仪器有限公司HG-9型；1cm石英比色皿

• FBGreen dsDNA 定量检测试剂盒， 1mL 单位量的试剂浓缩液足够 2mL 体积的 200 次测定。

1×TE（10mM Tris 1mM EDTA）pH8.0； 250ug/mL Sigma 小牛胸腺DNA

3.实验方案

  试剂制备

FBGreen dsDNA 定量试剂是以 1mL 的浓缩液形式保存在无水的 DMSO（二甲基亚砜）中。实 验当天，配制 2XFBGreen 试剂的操作溶液，用 1xTE 按 1:200 的比例稀释浓缩液（10mM Tris-HCl，

1mM EDTA，pH7.5）。如果要准备足够的操作溶液测定 20 个样品，可在 20mL1x TE 中加入 100μL FBGreen dsDNA 定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen 试剂 见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。

溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。

实验方法：

1). 标准品工作液的配制：

 Sigma小牛胸腺嘧啶DNA干粉（货号：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1mL双蒸水，配制成1mg∕mL的标准品工作液；

2). 染料工作液的配置：

6 uLFBGreen加入1mL TE(注意：用1×TE将FBKGreen稀释200倍，现用现配，注意避光)。

3). 标准品工作液稀释：

（1）母液稀释：取10ul（1mg∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成100ng∕mL；

（2）倍比稀释：取800ul （100ng∕mL）的标准品工作液加入到200ul TE溶液中，浓度达到80ng∕mL（药典规定：荧光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好， 该法DNA检出限为0.3 ng/ml），取500ul（80ng∕mL）的标准品工作液加入到500ul TE溶液中，浓度稀释到40ng∕mL；依次倍比稀释，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液；

        4).标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100ul混匀，避光室温放置5min。使用FB-15型便携式荧光仪检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/ml）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线。

5). 测量剩余样品的荧光值。荧光计将给出一个直接的浓度读数，数据可以用来产生DNA 浓度的标准曲线。

特别提醒：

1) 本公司所有产品仅限于专业人员用于生命科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅！

2) 本公司所有产品必须由合格专业技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程！