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Annexin V-Super Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒

磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜 PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光标记，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
采用Annexin V与PI双染的方法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。

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浏览量:

1000

产品编号

2022-20T/600元,100T/2000元

所属分类

细胞染色/凋亡及离子探针

数量

-

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产品描述

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Annexin V-Super Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒

磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜 PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行红色荧光Super Fluor 647标记，以标记了的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用Annexin V与PI双染的方法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。

图1. 细胞凋亡过程中磷脂酰丝氨酸（PS）外翻示意图

试剂盒组份：

Reagents	20 assays	50 assays	100 assays	Storage
Annexin V-Super Fluor 647	100 μl	250 μl	500 μl	4°C避光
Propidium Iodide, PI	200 μl	500 μl	1000 μl	4°C避光
Binding Buffer ( 4´ )	4 mL	10 mL	20 mL	4°C

所需实验器材：

微量移液器；PBS；不含EDTA的胰酶消化液；低速离心机；流式细胞仪

注意事项：

1) 所有产品仅限用于研发，必须生物技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程！

2) 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。

3) Propidium Iodide操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

4) Annexin V-Super Fluor 647操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

5) 本试剂盒用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量1x10⁵~1x10⁶。

6) 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

7) Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

8) 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-Super Fluor 647，最终导致染色失败。

9) 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

操作说明：

1. 细胞样品的准备：

a) 悬浮细胞：

1) 收集细胞至离心管中1000-2000rpm离心5min，小心去除上清。

2) 用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

3) 再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

b) 贴壁细胞：

1）吸出细胞培养液至离心管中，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。

2）室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

3）加入步骤i中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

注：加入步骤i中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-Super Fluor 647导致染色失败。

4）用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

5）再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

2. 用去离子水按1：4稀释Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去离子水）；

3. 用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/ml；

4. 取100ul的细胞悬液于5 ml流式管中，加入Annexin V- Super Fluor 647，轻轻混匀；

5. 室温(20-25℃)避光孵育10min；

6. 上机前5min加入10uL碘化丙啶溶液，轻轻混匀；

7. 上机前在反应管中补加400ml PBS重悬细胞，避光保存，随即进行流式细胞仪（FACS）检测， Annexin V- Alexa Fluor 647和PI均为红色荧光。

图2. 流式细胞仪检测早期凋亡细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。

特别提醒：

1) 本公司所有产品仅限于专业人员用于生命科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅！

2) 本公司所有产品必须由合格专业技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程！

参考文献：

1.Wu XX, Sun Y, Zhou XB, Zhang J, Yu BY, Xu Q.Effect of Bufotalin on the Apoptosis of BGC-823 Cells.Chinese medicine and clinical pharmacology of new drugs.2007 March,Vol.18 No.2.

2.Yang L, Zhou X, Yang J, Yin X, Han L, Zhao D. Aspirin inhibits cytotoxicity of prion peptide PrP106-126 to neuronal cells associated with microglia activation in vitro. J Neuroimmunol. 2008 Aug 13;199(1-2):10-7.

3. Gao C, Jiang Y, Tan C, Zu X, Liu H, Cao D. Synthesis and potent antileukemic activities of 10-benzyl-9(10H)-acridinones. Bioorg Med Chem. 2008 Sep 15;16(18):8670-5. Epub 2008 Aug 5.

4. Wang LM, Li QY, Zu YG, Fu YJ, Chen LY, Lv HY, Yao LP, Jiang SG. Anti-proliferative and pro-apoptotic effect of CPT13, a novel camptothecin analog, on human colon cancer HCT8 cell line. Chem Biol Interact. 2008 Nov 25;176(2-3):165-72. Epub 2008 Jul 30.

5. Wang L, Li Z, Wang C, Yang Y, Sun L, Cai X, Wu G, Zhou F, Zha X. E-cadherin decreased human breast cancer cells sensitivity to staurosporine by up-regulating Bcl-2 expression. Arch Biochem Biophys. 2009 Jan 1;481(1):116-22. Epub 2008 Nov 1.

6.Yan HL, Xue G, Mei Q, Wang YZ, Ding FX, Liu MF, Lu MH, Tang Y, Yu HY, Sun SH. Repression of the miR-17-92 cluster by p53 has an important function in hypoxia-induced apoptosis. EMBO J. 2009 Sep 16;28(18):2719-32. Epub 2009 Aug 20.

7. Ji YB, Qu ZY, Zou X. Juglone-induced apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells via the mitochondrial pathway. Exp Toxicol Pathol. 2009 Oct 6.

产品参数

Name	Annexin V-Super Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒
CAT#	2022	CAS#
Storage#	-20 °C Sealed & desiccated & Minimized light exposure & Minimized Freezing And Thawing	Shelf Life#	24 months
Ex(nm)#	647	Em(nm)#	668
MW#		Solvent#	DMSO

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